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中药传 统提取纯化分离工艺

发布时间:2014-04-29    字号:    
第一部分.中草药 有效成分的提取:


(一)溶剂提取法:


1.溶剂提取法的原理:溶剂提 取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质,选用对 活性成分溶解度大,对不需 要溶出成分溶解度小的溶剂,而将有 效成分从药材组织内溶解出来的方法。当溶剂 加到中草药原料(需适当粉碎)中时,溶剂由于扩散、渗透作 用逐渐通过细胞壁透入到细胞内,溶解了可溶性物质,而造成 细胞内外的浓度差,于是细 胞内的浓溶液不断向外扩散,溶剂又 不断进入药材组织细胞中,如此多次往返,直至细 胞内外溶液浓度达到动态平衡时,将此饱和溶液滤出,继续多次加入新溶剂,就可以 把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。

中草药 成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为水、亲本性 有机溶剂及亲脂性有机溶剂,被溶解 物质也有亲水性及亲脂性的不同。

有机化 合物分子结构中亲水性基团多,其极性大而疏于油;有的亲水性基团少,其。极性小而疏于水。这种亲水性、亲脂性 及其程度的大小,是和化 合物的分子结构直接相关。一般来说,两种基 本母核相同的成分,其分子 中功能基的极性越大,或极性 功能基数量越多,则整个分子的极性大,亲水性强,而亲脂性就越弱,其分子 非极性部分越大,或碳键越长,则极性小,亲脂性强,而亲水性就越弱。

各类溶剂的性质,同样也 与其分子结构有关。例如甲醇、乙醇是亲水性比较强的溶剂,它们的分子比较小,有羟基存在,与水的结构很近似,所以能 够和水任意混合。丁醇和 戊醇分子中虽都有羟基,保持和水有相似处,但分子逐渐地加大,与水性 质也就逐渐疏远。所以它 们能彼此部分互溶,在它们 互溶达到饱和状态之后,丁醇或 戊醇都能与水分层。氯仿、苯和石 油醚是烃类或氯烃衍生物,分子中没有氧,属于亲脂性强的溶剂。

这样,我们就 可以通过时中草药成分结构分析,去估计 它们的此类性质和选用的溶剂。例如葡萄糖、蔗糖等 分子比较小的多羟基化合物,具有强亲水性,极易溶于水,就是在 亲水性比较强的乙醇中也难于溶解。淀粉虽然羟基数目多,但分子大大,所以难溶解于水。蛋白质 和氨基酸都是酸碱两性化合物,有一定程度的极性,所以能溶于水,不溶于 或难溶子有机溶剂。甙类都 比其甙元的亲水性强,特别是 皂甙由于它们的分子中往往结合有多数糖分子,羟基数目多,能表现 出较强的亲水性,而皂甙 元则属于亲脂性强的化合物。多数游 离的生物碱是亲脂性化合物,与酸结合成盐后,能够离子化,加强了极性,就变为亲水的注质,这些生 物碱可称为半极性化合物。所以,生物碱 的盐类易溶于水,不溶或 难溶于有机溶剂;而多数 游离的生物碱不溶或难溶于水,易溶于亲脂性溶剂,一般以 在氯仿中溶解度最大。鞣质是 多羟基的化台物,为亲水性的物质。油脂、挥发油、蜡、脂溶性 色素都是强亲脂性的成分。

总的说来,只要中 草药成分的亲水性和亲脂性与溶剂的此项性质相当,就会在 其中有较大的溶解度,即所谓“相似相溶”的规律。这是选 择适当溶剂自中草药中提取所需要成分的依据之一。


2.溶剂的选择:运用溶 剂提取法的关键,是选择适当的溶剂。溶剂选择适当,就可以 比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶 剂要注意以下三点:①溶剂对 有效成分溶解度大,对杂质溶解度小;②溶剂不 能与中药的成分起化学变化;③溶剂要经济、易得、使用安全等。


常见的 提取溶剂可分为以下三类:

1)水:水是一 种强的极性溶剂。中草药 中亲水性的成分,如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱 盐及甙类等都能被水溶出。为了增 加某些成分的溶解度,也常采 用酸水及碱水作为提取溶剂。酸水提取,可使生 物碱与酸生成盐类而溶出,碱水提取可使有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素 以及酚类成分溶出。但用水 提取易酶解甙类成分,且易霉坏变质。某些含果胶、粘液质 类成分的中草药,其水提 取液常常很难过滤。沸水提取时,中草药 中的淀粉可被糊化,而增加过滤的困难。故含淀 粉量多的中草药,不宜磨 成细粉后加水煎煮。中药传统用的汤剂,多用中 药饮片直火煎煮,加温可 以增大中药成分的溶解度外,还可能 有与其他成分产生“助溶”现象,增加了 一些水中溶解度小的、亲脂性 强的成分的溶解度。但多数 亲脂性成分在沸水中的溶解度是不大的,既使有助溶现象存在,也不容易提取完全。如果应用大量水煎煮,就会增 加蒸发浓缩时的困难,且会溶出大量杂质,给进一 步分离提纯带来麻烦。中草药 水提取液中含有皂甙及粘液质类成分,在减压浓缩时,还会产生大量泡沫,造成浓缩的困难。通常可 在蒸馏器上装置一个汽一液分离防溅球加以克服,工业上 则常用薄膜浓缩装置。

2)亲水性的有机溶剂:也就是 一般所说的与水能混溶的有机溶剂,如乙醇(酒精)、甲醇(木精)、丙酮等,以乙醇最常用。乙醇的 溶解性能比较好,对中草 药细胞的穿透能力较强。亲水性 的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外,大多能在乙醇中溶解。难溶于 水的亲脂性成分,在乙醇 中的溶解度也较大。还可以 根据被提取物质的性质,采用不 同浓度的乙醇进行提取。用乙醇 提取比用水量较少,提取时间短,溶解出 的水溶性杂质也少。乙醇为有机溶剂,虽易燃,但毒性小,价格便宜,来源方便,有一定 设备即可回收反复使用,而且乙 醇的提取液不易发霉变质。由于这些原因,用乙醇 提取的方法是历来最常用的方法之一。甲醇的 性质和乙醇相似,沸点较低(64℃),但有毒性,使用时应注意。

3)亲脂性的有机溶剂:也就是 一般所说的与水不能混溶的有机溶剂,如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。这些溶 剂的选择性能强,不能或 不容易提出亲水性杂质。但这类溶剂挥发性大,多易燃(氯仿除外),一般有毒,价格较贵,设备要求较高,且它们 透入植物组织的能力较弱,往往需 要长时间反复提取才能提取完全。如果药 材中含有较多的水分,用这类 溶剂就很难浸出其有效成分,因此,大量提 取中草药原料时,直接应 用这类溶剂有一定的局限性。


3.提取方法:用溶剂 提取中草药成分,、常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提 取法及连续回流提取法等。同时,原料的粉碎度、提取时间、提取温度、设备条 件等因素也都能影响提取效率,必须加以考虑。

1)浸渍法:浸渍法 系将中草药粉末或碎块装人适当的容器中,加入适宜的溶剂(如乙醇、稀醇或水),浸渍药 材以溶出其中成分的方法。本法比较简单易行,但浸出率较差,且如用水为溶剂,其提取 液易于发霉变质)须注意 加入适当的防腐剂。

2)渗漉法:渗漉法 是将中草药粉末装在渗漉器中,不断添加新溶剂,使其渗透过药材,自上而 下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法小当溶剂渗进药粉溶出成分比重加大而向下移动时,上层的 溶液或稀浸液便置换其位置,造成良好的浓度差,使扩散能较好地进行,故浸出 效果优于浸渍法。但应控制流速,在渗渡 过程中随时自药面上补充新溶剂,使药材 中有效成分充分浸出为止。或当渗 滴液颜色极浅或渗涌液的体积相当于:原药材重的10倍时,便可认 为基本上已提取完全。在大量 生产中常将收集的稀渗淮液作为另一批新原料的溶剂之用。

3)煎煮法:煎煮法 是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿,不宜用铁锅,以免药液变色。直火加 热时最好时常搅拌,以免局 部药材受热太高,容易焦糊。有蒸汽 加热设备的药厂,多采用大反应锅、大铜锅、大木桶,或水泥 砌的池子中通入蒸汽加热。还可将 数个煎煮器通过管道互相连接,进行连续煎浸。

4)回流提取法:应用有 机溶剂加热提取,需采用回流加热装置,以免溶剂挥发损失。小量操作时,可在圆 底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内装 药材约为容量的%~%,溶剂浸过药材表面约1~2cm。在水浴中加热回流,一般保持沸腾约:小时小放冷过滤,再在药渣中加溶剂,作第二、三次加 热回流分别约半小时,或至基 本提尽有效成分为止。此法提 取效率较冷浸法高,大量生 产中多采用连续提取法。

5)动连续提取法:应用挥 发性有机溶剂提取中草药有效成分,不论小 型实验或大型生产,均以连续提取法为好,而且需用溶剂量较少,提取成分也较完全。实验室 常用脂肪提取器或称索氏提取器。连续提取法,一般需 数小时才能提取完全。提取成 分受热时间较长,遇热不 稳定易变化的成分不宜采用此法。


(二)水蒸气蒸馏法:水蒸气蒸馏法,适用于 能随水蒸气蒸馏而不被破坏的中草药成分的提取。此类成分的沸点多在100℃以上,与水不 相混溶或仅微溶,且在约100℃时存一定的蒸气压。当与水在一起加热时,其蒸气 压和水的蒸气压总和为一个大气压时,液体就开始沸腾,水蒸气 将挥发性物质一并带出。例如中 草药中的挥发油,某些小 分子生物碱一麻黄碱、萧碱、槟榔碱,以及某 些小分子的酚性物质。牡丹酚(paeonol)等,都可应用本法提取。有些挥 发性成分在水中的溶解度稍大些,常将蒸馏液重新蒸馏,在最先蒸馏出的部分,分出挥发油层,或在蒸 馏液水层经盐析法并用低沸点溶剂将成分提取出来。例如玫瑰油、原白头翁素(protoanemonin)等的制备多采用此法。


(三)升华法:固体物 质受热直接气化,遇冷后 又凝固为固体化合物,称为升华。中草药 中有一些成分具有升华的性质,故可利 用升华法直接自中草药中提取出来。例如樟 木中升华的樟脑(camphor),在《本草纲目》中已有详细的记载,为世界 上最早应用升华法制取药材有效成分的记述。茶叶中的咖啡碱在178℃以上就 能升华而不被分解。游离羟基蒽醌类成分,一些香豆素类,有机酸类成分,有些也 具有升华的性质。例如七 叶内酯及苯甲酸等。

升华法虽然简单易行,但中草药炭化后,往往产 生挥发性的焦油状物,粘附在升华物上,不易精制除去,其次,升华不完全,产率低,有时还 伴随有分解现象。


第二部分.分离和纯化:


上述提 取法所得到的中草药提取液或提取物仍然是混合物,需进一步除去杂质,分离并进行精制。具体的 方法随各中草药的性质不同而异,以后将 通过实例加以叙述,此处只 作一般原则性的讨论。

(一)溶剂分离法:一般是 将上述总提取物,选用三、四种不同极性的溶剂,由低极 性到高极性分步进行提取分离。水浸膏 或乙醇浸膏常常为胶伏物,难以均 匀分散在低极性溶剂中,故不能提取完全,可拌人 适量惰性填充剂,如硅藻土或纤维粉等,然后低温或自然干燥,粉碎后,再以选 用溶剂依次提取,使总提 取物中各组成成分,依其在 不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。例如粉防己乙醇浸膏,碱化后 可利用乙醚溶出脂溶性生物碱,再以冷 苯处理溶出粉防己碱,与其结 构类似的防己诺林碱比前者少一甲基而有一酚羟基,不溶于 冷苯而得以分离。利用中草药化学成分,在不同 极性溶剂中的溶解度进行分离纯化,是最常用的方法。

广而言之,自中草 药提取溶液中加入另一种溶剂,析出其 中某种或某些成分,或析出其杂质,也是一 种溶剂分离的方法。中草药 的水提液中常含有树胶、粘液质、蛋白质、糊化淀粉等,可以加 入一定量的乙醇,使这些 不溶于乙醇的成分自溶液中沉淀析出,而达到 与其它成分分离的目的。例如自 中草药提取液中除去这些杂质,或自白 及水提取液中获得白及胶,可采用加乙醇沉淀法;自新鲜 括楼根汁中制取天花粉素,可滴人 丙酮使分次沉淀析出。目前,提取多 糖及多肽类化合物,多采用水溶解、浓缩、加乙醇 或丙酮析出的办法。

此外,也可利 用其某些成分能在酸或碱中溶解,又在加 碱或加酸变更溶液的pH后,成不溶 物而析出以达到分离。例如内 酯类化合物不溶于水,但遇碱 开环生成羧酸盐溶于水,再加酸酸化,又重新 形成内酯环从溶液中析出,从而与其它杂质分离;生物碱一般不溶于水,遇酸生 成生物碱盐而溶于水,再加碱碱化,又重新 生成游离生物碱。这些化 合物可以利用与水不相混溶的有机溶剂进行萃取分离。一般中 草药总提取物用酸水、碱水先后处理,可以分为三部分:溶于酸 水的为碱性成分(如生物碱),溶于碱 水的为酸性成分(如有机酸),酸、碱均不 溶的为中性成分(如甾醇)。还可利用不同酸、碱度进一步分离,如酸性 化台物可以分为强酸性、弱酸性 和酷热酚性三种,它们分 别溶于碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钠,借此可进行分离。有些总生物碱,如长春花生物碱、石蒜生物碱,可利用不同rH值进行分离。但有些特殊情况,如酚性 生物碱紫董定碱(corydine)在氢氧 化钠溶液中仍能为乙醚抽出,蝙蝠葛碱(dauricins)在乙醚 溶液中能为氢氧化钠溶液抽出,而溶于 氯仿溶液中则不能被氢氧化钠溶液抽出;有些生物碱的盐类,如四氢 掌叶防己碱盐酸盐在水溶液中仍能为氯仿抽出。这些性 质均有助于各化合物的分离纯化。


(二)两相溶剂萃取法:


1.萃取法:两相溶 剂提取又简称萃取法,是利用 混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。萃取时 如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大,则分离效率越高、如果在 水提取液中的有效成分是亲脂性的物质,一般多 用亲脂性有机溶剂,如苯、氯仿或 乙醚进行两相萃取,如果有 效成分是偏于亲水性的物质,在亲脂 性溶剂中难溶解,就需要 改用弱亲脂性的溶剂,例如乙酸乙酯、丁醇等。还可以在氯仿、乙醚中 加入适量乙醇或甲醇以增大其亲水性。提取黄酮类成分时,多用乙 酸乙脂和水的两相萃取。提取亲 水性强的皂甙则多选用正丁醇、异戊醇 和水作两相萃取。不过,一般有 机溶剂亲水性越大,与水作 两相萃取的效果就越不好,因为能 使较多的亲水性杂质伴随而出,对有效 成分进一步精制影响很大。

两相溶 剂萃取在操作中还要注意以下几点:

1)先用小 试管猛烈振摇约1分钟,观察萃 取后二液层分层现象。如果容易产生乳化,大量提 取时要避免猛烈振摇,可延长萃取时间。如碰到乳化现象,可将乳化层分出,再用新溶剂萃取;或将乳化层抽滤,或将乳化层稍稍加热;或较长 时间放置并不时旋转,令其自然分层。乳化现象较严重时,可以采 用二相溶剂逆流连续萃取装置。

2) 水提取 液的浓度最好在比重1.1~1.2之间,过稀则溶剂用量太大,影响操作。

3) 溶剂与 水溶液应保持一定量的比例,第一次提取时,溶剂要多一些,一般为水提取液的1/3,以后的 用量可以少一些,一般1/4-1/6。

4)一般萃取3~4次即可。但亲水 性较大的成分不易转入有机溶剂层时,须增加萃取次数,或改变萃取溶剂。

萃取法所用设备,如为小量萃取,可在分液漏斗中进行;如系中量萃取,可在较 大的适当的下口瓶中进行。在工业 生产中大量萃取,多在密 闭萃取罐内进行,用搅拌 机搅拌一定时间,使二液充分混合,再放置令其分层;有时将 两相溶液喷雾混含,以增大萃取接触,提高萃取效率,也可采 用二相溶剂逆流连续萃取装置。

2.逆流连续萃取法:是一种 连续的两相溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多的萃取管。管内用 小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充,以增加 两相溶剂萃取时的接触面。例如用 氯仿从川楝树皮的水浸液中萃取川楝素。将氯仿盛于萃取管内,而比重 小于氯仿的水提取浓缩液贮于高位容器内,开启活塞,则水浸 液在高位压力下流入萃取管,遇瓷圈 撞击而分散成细粒,使与氯仿接触面增大,萃取就比较完全。如果一 种中草药的水浸液需要用比水轻的苯、乙酸乙酯等进行萃取,则需将 水提浓缩液装在萃取管内,而苯、乙酸乙 酯贮于高位容器内。萃取是否完全,可取样品用薄层层析、纸层析 及显色反应或沉淀反应进行检查。

3.逆流分配法(CounterCurrentDistribution,CCD):逆流分 配法又称逆流分溶法、逆流分 布法或反流分布法。逆流分 配法与两相溶剂逆流萃取法原理一致,但加样量一定,并不断 在一定容量的两相溶剂中,经多次 移位萃取分配而达到混合物的分离。本法所 采用的逆流分布仪是由若干乃至数百只管子组成。若无此仪器,小量萃 取时可用分液漏斗代替。预先选 择对混合物分离效果较好,即分配 系数差异大的两种不相混溶的溶剂。并参考 分配层析的行为分析推断和选用溶剂系统,通过试 验测知要经多少次的萃取移位而达到真正的分离。逆流分 配法对于分离具有非常相似性质的混合物,往往可 以取得良好的效果。但操作时间长,萃取管 易因机械振荡而损坏,消耗溶剂亦多,应用上 常受到一定限制。

4.液滴逆流分配法:液滴逆 流分配法又称液滴逆流层析法。为近年 来在逆流分配法基础上改进的两相溶剂萃取法。。对溶剂 系统的选择基本同逆流分配法,但要求 能在短时间内分离成两相,并可生成有效的液滴。由于移动相形成液滴,在细的 分配萃取管中与固定相有效地接触、摩擦不 断形成新的表面,促进溶 质在两相溶剂中的分配,故其分 离效果往往比逆流分配法好。且不会产生乳化现象,用氮气压驱动移动相,被分离 物质不会因遇大气中氧气而氧化。本法必 须选用能生成液滴的溶剂系统,且对高 分子化合物的分离效果较差,处理样品量小(1克以下),并要有一定设备。应用液 滴逆流分配法曾有效地分离多种微量成分如柴胡皂甙原小檗碱型季铵碱等。液滴逆 流分配法的装置,近年来虽不断在改进,但装置和操作较繁。目前,对适用 于逆流分配法进行分离的成分,可采用 两相溶剂逆流连续萃取装置或分配柱层析法进行。

(三)沉淀法:是在中 草药提取液中加入某些试剂使产生沉淀,以获得 有效成分或除去杂质的方法。

1. 铅盐沉淀法:铅盐沉 淀法为分离某些中草药成分的经典方法之一。由于醋 酸铅及碱式醋酸铅在水及醇溶液中,能与多 种中草药成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀,故可利 用这种性质使有效成分与杂质分离。中性醋 酸铅可与酸性物质或某些酚性物质结合成不溶性铅盐。因此,常用以沉淀有机酸、氨基酸、蛋白质、粘液质、鞣质、树脂、酸性皂甙、部分黄酮等。可与碱 式醋酸铅产生不溶性铅盐或络合物的范围更广。通常将 中草药的水或醇提取液先加入醋酸铅浓溶液,静置后滤出沉淀,并将沉 淀洗液并入滤液,于滤液 中加碱式醋酸铅饱和溶液至不发生沉淀为止,这样就 可得到醋酸铅沉淀物、碱式醋 酸铅沉淀物及母液三部分。

然后将 铅盐沉淀悬浮于新溶剂中,通以硫化氢气体,使分解 并转为不溶性硫化铅而沉淀。含铅盐 母液亦须先如法脱铅处理,再浓缩精制。硫化氢脱铅比较彻底,但溶液 中可能存有多余的硫化氢,必须先 通人空气或二氧化碳让气泡带出多余的硫化氢气体,以免在 处理溶液时参与化学反应。新生态 的硫化铅多为胶体沉淀,能吸咐 药液中的有效成分,要注意 用溶剂处理收回。脱铅方法,也可用硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸钠等除铅,但硫酸铅、磷酸铅 在水中仍有一定的溶解度,除铅不彻底。用阳离 子交换树脂脱铅快而彻底,但要注 意药液中某些有效成分也可能被交换上去,同时脱 铅树脂再生也较困难。还应注 意脱铅后溶液酸度增加,有时需 中和后再处理溶液,有时可 用新制备的氢氧化铅、氢氧化铝、氢氧化铜或碳酸铅、明矾等代替醋酸铅、碱式醋酸铅。例如在 黄芩水煎液中加入明矾溶液,黄芩甙 就与铝盐络合生成难溶于水的络化物而与杂质分离,这种络 化物经用水洗净就可直接供药用。

2. 试剂沉淀法:例如在 生物碱盐的溶液中,加入某 些生物碱沉淀试剂(见生物碱性质下),则生物 碱生成不溶性复盐而析出。水溶性 生物碱难以用萃取法提取分出,常加入 雷氏铵盐使生成生物碱雷氏盐沉淀析出。又如橙皮甙、芦丁、黄芩甙、甘草皂 甙均易溶于碱性溶液,当加入 酸后可使之沉淀析出。某些蛋白质溶液,可以变更溶液的pH值利用 其在等电点时溶解度最小的性质而使之沉淀析出。此外,还可以用明胶、蛋白溶液沉淀鞣质;胆甾醇 也常用以沉淀洋地黄皂甙等。可根据 中草药有效成分和杂质的性质,适当选用。

(四)盐析法:盐析法 是在中草药的水提液中、加入无 机盐至一定浓度,或达到饱和状态,可使某 些成分在水中的溶解度降低沉淀析出,而与水 溶性大的杂质分离。常用作 盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。例如三 七的水提取液中加硫酸镁至饱和状态,三七皂 甙乙即可沉淀析出,自黄藤 中提取掌叶防己碱,自三颗 针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠或硫酸按盐析制备。有些成 分如原白头翁素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大,在提取时,亦往往 先在水提取液中加入一定量的食盐,再用有机溶剂萃取。

(五)透析法:透析法 是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜,而大分 子物质不能通过半透膜的性质,达到分离的方法。例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时,可用透 析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也 可将大分子的杂质留在半透膜内,而将小 分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中,而加以分离精制:透析是 否成功与透析膜的规格关系极大。透析膜 的膜孔有大有小,要根据 欲分离成分的具体情况而选择。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜(硫酸纸膜)、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。油常多 用市售的玻璃纸或动物性半透膜扎成袋状,外面用 尼龙网袋加以保护,小心加 入欲透析的样品溶液,悬挂在清水容器中。经常更 换清水使透析膜内外溶液的浓度差加大,必要时适当加热,并加以搅拌,以利透析速度加快。为了加快透析速度,还可应用电透析法,即在半在半透膜旁边纯溶剂两端

放置二个电极,接通电路,则透析 膜中的带有正电荷的成分如无机阳离子、生物碱等向阴极移动,而带负 电共荷的成分如无机阴离子、有机酸 等则向阳极移动,中性化 合物及高分子化合物则留在透析膜中。透析是否完全,须取透 析膜内溶液进行定性反应检查。

一般透析膜可以自制:动物半透膜如猪、牛的膀胱膜、用水洗净,再以乙醚脱脂,,即可供用;羊皮纸 膜可将滤纸浸入50%的硫酸15~60分钟,取出铺在板上,以水冲洗制得。其膜孔 大小与硫酸浓度、浸泡时 间以及用水冲洗速度有关;火棉胶 膜系将火棉胶溶于乙醚及无水乙醇,涂在板上,干后放 置水中即可供用,其膜孔 大小与溶剂种类、溶剂挥发速度有关,溶剂中 加入适量水可使膜孔增大,加入少 量醋酸可使膜孔缩小;蛋白质胶(明胶)膜可用20%明胶涂于细布上,阴干后放水中,再加甲醛使膜凝固,冲洗干净即可供用。近来商 品有透析膜管成品出售,国外习称“ViskingDialysisTubing”,有各种大小厚度规格,可供不 同大小分子量的多糖、多肽透析时选用。

(六)结晶、重结晶和分步结晶法:鉴定中草药化学成分,研究其化学结构,必须首 先将中草药成分制备成单体纯品。在常温下,物质本 身性质是液体的化台物,可分别 用分馏法或层析法进行分离精制。一般他说,中草药 化学成分在常温下多半是固体的物质,都具有结晶他的通性,可以根 据溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。研究中 草药化学成分时,一旦获得结晶,就能有 效地进一步精制成为单体纯品。纯化台 物的结晶有一定的熔点和结晶学的特征,有利于鉴定。如果鉴 定的物质不是单体纯品,不但不 能得出正确的结论,还会造 成工作上的浪费。因此,求得结 晶并制备成单体纯品,就成为 鉴定中草药成分、研究其 分子结构重要的一步。

1.杂质的除去:中草药 经过提取分离所得到的成分,大多仍然含有杂质,或者是混合成分。有时即 使有少量或微量杂质存在,也能阻 碍或延缓结晶的形成。所以在制备结晶时,必须注意杂质的干扰,应力求尽可能除去。有时可 选用溶剂溶出杂质,或只溶 出所需要的成分。有时可 用少量活性炭等进行脱色处理,以除去有色杂质。有时可通过氧化铝,硅胶或 硅藻土短柱处理后,再进行制备结晶。但应用 吸附剂除去杂质时,要注意 所需要的成分也可能被吸附而损失。此外,层析法 更是分离制备单体纯品所常用的有效方法。

如果一 再处理仍未能使近于纯品的成分结晶化,则可先 制备其晶态的衍生物,再回收原物,可望得到结晶。例如游 离生物碱可制备各种生物碱盐类,羟基化 合物可转变成乙酸化物,碳基化 台物可制备成苯踪衍生物结晶。美登碱 在原料中含量少,且反复 分离精制难以得到结晶,但制备成3一滇丙 基美登碱结晶后,再经水解除去澳丙基,美登碱 就能制备成为结晶。

2.溶剂的选择;制备结晶,要注意 选择合宜的溶剂和应用适量的溶剂。合宜的溶剂,最好是 在冷时对所需要的成分溶解度较小,而热时溶解度较大。溶剂的 沸点亦不宜太高。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙醋等。但有些化合物在一般溶剂中不易形成结晶,而在某 些溶剂中则易于形成结晶。例如葛根素、逆没食子酸(ellagicacid)在冰醋 酸中易形成结晶,大黄素(emodin)在吡啶中易于结晶,萱草毒素(hemerocallin)在N,N一二甲基甲酞胺(DMF)中易得到结晶,而穿心 莲亚硫酸氢钠加成物在丙酮一水中较易得到结晶。又如蝙 蝠葛碱通常为无定形粉未,但能和 氯仿或乙醚形成为加成物结晶。

3.结晶溶液的制备:制备结晶的溶液,需要成 为过饱和的溶液。一般是 应用适量的溶剂在加温的情况下,将化合 物溶解再放置冷处。如果在 室温中可以析出结晶,就不一 定放置于冰箱中,以免伴 随结晶析出更多的杂质。

“新生态”的物质 即新游离的物质或无定形的粉未状物质,远较晶 体物质的溶解度大,易于形成过饱和溶液。一般经 过精制的化合物,在蒸去 溶剂抽松为无定形粉未时就是如此,有时只 要加入少量溶剂,往往立即可以溶解,稍稍放 置即能析出结晶。例如长 春花总弱碱部分抽松后加入1.5倍量的甲醇溶解,放置后 很诀析出长春碱结晶。又如蝙 蝠葛碱在乙醚中很难溶解,但当其 盐的水溶液用氨液碱化,并立即用乙醚萃取,所得的乙醚溶液,放置后 即可析出蝙蝠葛碱的乙醚加成物结晶。

制备结晶溶液,除选用单一溶剂外,也常采用混合溶剂。一般是 先将化合物溶于易溶的溶剂中,再在室 温下滴加适量的难溶的溶剂,直至溶液微呈浑浊,并将此溶液微微加温,使溶液 完全澄清后放置。例如J一细辛醚重结晶时,可先溶于乙醇,再滴加适量水,即可析出很好的结晶。又如自 虎杖中提取水溶性的虎杖甙时,在已精 制饱和的水溶液上添加一层乙醚放置,既有利 于溶出其共存的脂溶性杂质,又可降低水的极性,促使虎杖俄的结晶化。自秦皮中提取七叶甙(秦皮甲素),也可运用这样的办法。

结晶过程中,一般是溶液浓度高,降温诀,析出结 晶的速度也快些。但是其 结晶的颗粒较小,杂质也可能多些。有时自 溶液中析出的速度太快,超过化 合物晶核的形成劝分子定向排列的速度,往往只 能得到无定形粉未。有时溶液太浓,粘度大 反而不易结晶化。如果溶液浓度适当,温度慢慢降低,有可能 析出结晶较大而纯度较高的结晶。有的化 合物其结晶的形成需要较长的时间,例如铃兰毒甙等,有时需 放置数天或更长的时间。

4.制备结晶操作:制备结 晶除应注意以上各点外,在放置过程中,最好先塞紧瓶塞,避免液面先出现结晶,而致结晶纯度较低。如果放 置一段时间后没有结晶析出,可以加 入极微量的种晶,即同种 化合物结晶的微小颗粒。加种晶 是诱导晶核形成常用而有效的手段。一般他说,结晶化 过程是有高度选择性的,当加入 同种分子或离子,结晶多会立即长大。而且溶 液中如果是光学异构体的混合物,还可依 种晶性质优先析出其同种光学异构体。没有种晶时,可用玻 璃棒蘸过饱和溶液一滴,在空气中任溶剂挥散,再用以 磨擦容器内壁溶液边缘处,以诱导结晶的形成。如仍无结晶析出,可打开 瓶塞任溶液逐步挥散,慢慢析晶。或另选适当溶剂处理,或再精制一次,尽可能 除尽杂质后进行结晶操作。

5.重结晶及分步结晶:在制备结晶时,最好在 形成一批结晶后,立即倾出上层溶液,然后再 放置以得到第二批结晶。晶态物 质可以用溶剂溶解再次结晶精制。这种方 法称为重结晶法。结晶经 重结晶后所得各部分母液,再经处 理又可分别得到第二批、第三批结晶。这种方 法则称为分步结晶法或分级结晶法。晶态物 质在一再结晶过程中,结晶的 析出总是越来越快,纯度也越来越高。分步结 晶法各部分所得结晶,其纯度 往往有较大的差异,但常可 获得一种以上的结晶成分,在未加 检查前不要贸然混在一起。

6.结晶纯度的判定:化合物 的结晶都有一定的结晶形状、色泽、熔点和熔距,一可以 作为鉴定的初步依据。这是非 结晶物质所没有的物理性质。化合物 结晶的形状和熔点往往因所用溶剂不同而有差异。原托品 碱在氯仿中形成棱往状结晶,熔点207℃;在丙酮 中则形成半球状结晶,熔点203℃;在氯仿 和丙酮混合溶剂中则形成以上两种晶形的结晶。又如N一氧化苦参碱,在无水 丙酮中得到的结晶熔点208℃,在稀丙酮(含水)析出的结晶为77~80℃。所以文 献中常在化合物的晶形、熔点之 后注明所用溶剂。一般单 体纯化合物结晶的熔距较窄,有时要求在0.5℃左右,如果熔 距较长则表示化合物不纯。

但有些例外情况,特别是 有些化合物的分解点不易看得清楚。也有的 化合物熔点一致,熔距较窄,但不是单体。一些立 体异构体和结构非常类似的混合物,常有这样的现象。还有些 化合物具有双熔点的特性,即在某 一温度已经全部融熔,当温度 继续上升时又固化,再升温 至一定温度又熔化或分解。如防己诺林碱在1760C时熔化,至200℃时又固化,再在2420C时分解。中草药 成分经过同一溶剂进行三次重结晶,其晶形及熔点一致,同时在 薄层层析或纸层层析法经数种不同展开剂系统检定,也为一个斑点者,一般可 以认为是一个单体化合物。但应注意,有的化 合物在一般层析条件下,虽然只呈现一个斑点,但并不 一定是单体成分。例如鹿 含草中主成分为高熊果砍,异高熊 果甙极难用一般方法分离,经反复结晶后,在纸层 及聚酞胺薄层上都只有一个斑点,易误认为单一成分,但测其熔点在115~125℃,熔距很长。经制备其甲醚后,再经纸层层析检定,可以出现两个斑点,异高熊 果甙的比移值大于高熊果甙。又如水 菖蒲根茎挥发油中的α一细辛醚和β一细辛醚,在一般 薄层上均为一个斑点,前者为结晶,熔点63℃,后者为液体沸点296℃,用硝酸 银薄层或气相层忻很容易区分。有时个别化合物(如氨基酸)可能部 分地与层析纸或薄层上的微量金属离子(如Cu)、酸或碱形成络合物、盐或分解而产生复斑。因此,判定结晶纯度时,要依据 具体情况加以分析。此外,高压液谱、气相层析、紫外光谱等,均有助 于检识结晶样品的纯度。

第三部分.层析法:

层析技 术的应用与发展,对于植 物各类化学成分的分离鉴定工作起到重大的推动作用。如中药 丹参的化学成分在30年代仅从中分离到3种脂溶性色素,分别称为丹参酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后进一步的研究,发现除丹参酮Ⅰ为纯品外,Ⅱ、Ⅲ、均为混合结晶。此后通 过各种层析方法,迄今已发现15种单体(其中有4种为我国首次发现)。目前新 的层析技术不断发展,随着层 析理论和电子学、光学、计算机等技术的应用,层析技术已日趋完善。

一.层析法的基本原理:

层析过 程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之 间的分配系数之差(分配层析),组分对 吸附剂吸附能力不同(吸附层析),和寓子交换,分子的大小(排阻层析)而分离。通常又 将一般的以流动相为气体的称为气相层析,流动相 为液体的称为液相层析。

一、 吸附层析法(AdsorptionChromatography)

(一)吸附剂、溶剂与 被分离物性质的关系:液一固 吸附层析是运用较多的一种方法,特别适 用于很多中等分子量的样品(分子量小于1,000的低挥发性样品)的分离,尤其是 脂溶性成分一一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或 离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果,决定于吸附剂、溶剂和 被分离化合物的性质这三个因素。

1. 吸附剂:常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。

(1) 硅胶:层析用 硅胶为一多孔性物质,分子中 具有硅氧烷的交链结构,同时在颗

粒表面 又有很多硅醇基。硅胶吸 附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基 能够通过氢键的形成而吸附水分,因此硅 胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17%,吸附力 极弱不能用作为吸附剂,但可作 为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化,当硅胶加热至100~110℃时,硅胶表 面因氢键所吸附的水分即能被除去。当温度升高至500℃时,硅胶表 面的硅醇基也能脱水缩台转变为硅氧烷键,从而丧 失了因氢键吸附水分的活往,就不再 有吸附剂的性质,虽用水 处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅 胶的活化不宜在较高温度进行(一般在170cC以上即 有少量结合水失去)。

硅胶是 一种酸性吸附剂,适用于 中性或酸性成分的层析。同时硅 胶又是一种弱酸性阳离子交换剂,其表面 上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子,当遇到 较强的碱注化台物,则可因 离子交换反应而吸附碱性化合物。

(2)氧化铝:氧化铝可能带有碱性(因其中 可混有碳酸钠等成分),对于分 离一些碱性中草药成分,如生物 碱类的分离颇为理想。但是碱 性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等 类型的化合物分离。因为有 时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应,如异构化、氧化、消除反应等。除去氧 化铝中绚碱性杂质可用水洗至中性,称为中性氧化铝。中性氧 化铝仍属于碱性吸附剂的范畴,本适用 于酸性成分的分离。用稀硝 酸或稀盐酸处理氧化铝,不仅可 中和氧化铝中含有的碱性杂质,并可使 氧化铝颗粒表面带有NO3一或CI一的阴离子,从而具 有离于交换剂的性质,适合于 酸性成分的层析,这种氧 化铝称为酸性氧化铝。供层析用的氧化铝,用于拄层析的,其粒度要求在100~160目之间。粒度大子100目,分离效果差:小于160目,溶浓流速大慢,易使谱带扩散。样品与 氧化铝的用量比,一般在1:20~50之间层 析柱的内径与柱长比例在1:10-20之向。

在用溶剂冲洗柱时,流速不宜过快,洗脱液 的流速一般以每半~1小时内 流出液体的毫升数与所用吸附剂的重量(克)相等为合适。

(3)活性炭:是使用 较多的一种非极性吸附剂。一般需 要先用稀盐酸洗涤,其次用乙醇洗,再以水洗净,于80℃干燥后即可供层析用。层析用的活性炭,最好选用颗粒活注炭,若为活性炭细粉,则需加 入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱,以免流速太慢。活性炭 主要且于分离水溶性成分,如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭 的有为吸附作用,在水溶液中最强,在有机 溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱,而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时,则随乙 醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭 对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物,对大分 子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这 些吸附性的差别,可将水 溶性芳香族物质与脂肪族物质分开,单糖与多糖分开,氨基酸与多肽分开。

2.溶剂:层析过 程中溶剂的选择,对组分分离关系极大。在柱层 析时所用的溶剂(单一剂或混合溶剂)习惯上称洗脱剂,用于薄 层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择,须根据 被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时,当被分 离物质为弱极性物质,一般选 用弱极性溶剂为洗脱剂;被分离 物质为强极性成分,则须选 用极性溶剂为洗脱剂。如果对 某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂(如以硅 藻土或滑石粉代替硅胶),则洗脱 剂的极性亦须相应降低。

在柱层操作时,被分离 样品在加样时可采用于法,亦可选 一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样 品的溶剂应选择极性较小的,以便被 分离的成分可以被吸附。然后渐 增大溶剂的极性。这种极 性的增大是一个十分缓慢的过程,称为“梯度洗脱”,使吸附 在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀(梯度太大),就不能 获得满意的分离。溶剂的洗脱能力,有时可 以用溶剂的介电常数(ε)来表示。介电常数高,洗脱能力就大。以上的 洗脱顺序仅适用于极性吸附剂,如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂,如活性炭,则正好 与上述顺序相反,在水或 亲水住溶剂中所形成的吸附作用,较在脂 溶性溶剂中为强。

3.被分离物质的性质:被分离 的物质与吸附剂,洗脱剂 共同构成吸附层析中的三个要素,彼此紧密相连。在指定 的吸附剂与洗脱剂的条件下,各个成分的分离情况,直接与 被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言,成分的极性大,吸附住强。

当然,中草药 成分的整体分子观是重要的,例如极 性基团的数目愈多,被吸附 的住能就会更大些,在同系 物中碳原子数目少些,被吸附也会强些。总之,只要两 个成分在结构上存在差别,就有可能分离,关键在于条件的选择。要根据 被分离物质的性质,吸附剂的吸附强度,与溶剂 的性质这三者的相互关系来考虑。首先要 考虑被分离物质的极性。如被分 离物质极性很小为不含氧的萜烯,或虽含 氧但非极性基团,则需选 用吸附性较强的吸附剂,并用弱 极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数 中药成分的极性较大,则需要 选择吸附性能较弱的吸附剂(一般Ⅲ~Ⅳ级)。采用的 洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增,或可应 用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外,能否获得满意的分离,还与选 择的溶剂梯度有很大关系。现以实 例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂 与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物,象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三 酸醋和脂肪酸等组份。当以硅胶为吸附剂时,使油脂 被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱,油脂中 各单一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脱。

又如对于C-27甾体皂甙元类成分,能因其 分字中羟基数目的多少而获得分离:将混合 皂甙元溶于含有5%氯仿的苯中,加于氧 化铝的吸附柱上,采用以 下的溶剂进行梯度洗脱。如改用 吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝,由于硅 酸镁的吸附性较弱,洗脱剂 的极牲需相应降低,亦即采用苯或含5%氯仿的苯,即可将 一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明,同样的 中草药成分在不同的吸附剂中层析时,需用不 同的溶剂才能达到相同的分离效果,从而说明吸附剂、溶剂和 欲分离成分三者的相互关系。

(二)簿层层析:薄层层析是一种简便、快速、微量的层析方法。一般将 柱层析用的吸附剂撒布到平面如玻璃片上,形成一 薄层进行层析时一即称薄层层析。其原理 与柱层析基本相似。

1.薄层层析的特点:薄层层 析在应用与操作方面的特点与柱层析的比较。

2.吸附剂的选择:薄层层 析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。主要区 别在于薄层层析要求吸附剂(支持剂)的粒度更细,一般应小于250目,并要求粒度均匀。用于薄 层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高,以Ⅱ~Ⅲ级为宜。而展开 距离则随薄层的粒度粗细而定,薄层粒度越细,展开距离相应缩短,一般不超过10厘米,否则可 引起色谱扩散影响分离效果。

3.展开剂的选择:薄层层析,当吸附 剂活度为一定值时(如Ⅱ或Ⅲ级),对多组 分的样品能否获得满意的分离,决定于展开剂的选择。中草药 化学成分在脂溶性成分中,大致可 按其极性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性。但在实际工作中,经常需 要利用溶剂的极性大小,对展开 剂的极性予以调整。

4o特殊薄层:针对某 些性质特殊的化合物的分离与检出,有时需 采用一些特殊薄层。

① 荧光薄层:有些化合物本身无色,在紫外 灯下也不显荧光,又无适当的显色剂时,则可在 吸附剂中加入荧光物质制成荧光薄层进行层析。展层后 置于紫外光下照射,薄层板本身显荧光,而样品 斑点处不显荧光,即可检 出样品的层析位置。常用的 荧光物质多为无机物。其一是在 254nm紫外光 激发下显出荧光的,如锰激洁的硅酸锌。另一种为在365nm紫外光 激发下发出荧光的,如银激 化的硫化锌硫化镐。

② 络合薄层:常用的有硝酸银薄层,用来分 离碳原子数相等而其中C一C双键数 目不等的一系列化合物,如不饱和醇、酸等。其主要机理是由于C一C键能与 硝酸银形成络合物,而饱和的C一C键则不与硝酸银络合。因此在硝酸银薄层上,化台物 可由于饱和程度不同而获得分离。层析时 饱和化合物由于吸附最弱而Rf最高,含一个 双键的较含两个双键的Rf值高,含一个 三键的较含一个双键的Rf值高。此外,在一个双键化台物中,顺式的 与硝酸银络合较反式的易于进行。因此,还可用 来分离顺反异构体。

③ 酸碱薄层和PH缓冲薄层:为了改 变吸附剂原来的酸碱性,可在铺 制薄层时采用稀酸或稀碱以代替水调制薄层。例如硅胶带微酸性,有时对 碱性物质如生物碱的分离不好,如不能展层或拖尾,则可在铺薄层时,用稀碱溶液0.1~0.5NNa0H溶液制 成碱性硅胶薄层。例如***豆碱在 以硅胶为吸附剂时,以氯仿-丙酮一甲醇(8:2:1)为展开剂Rf<0.1,采用碱 性硅胶薄层用上述相同展开剂,Rf值增至0.4左右。说明***豆碱为--碱性生物碱。

5.应用:薄层层 析法在中草药化学成分的研究中,主要应 用于化学成分的预试、化学成 分的鉴定及探索柱层分离的条件。

用薄层 层析法进行中草药化学成分预试,可依据 各类成分性质及熟知的条件,有针对性地进行。由于在薄层上展层后,可将一些杂质分离,选择性高,可使预 试结果更为可靠。

以薄层 层析法进中草药化学成分鉴定,最好要 有标准样品进行共薄层层析。如用数种溶剂展层后,标准品和鉴定品的Rf值、斑点形 状颜色都完全相同,则可作 初步结论是同一化合物。但一般 需进行化学反应或红外光谱等一种仪器分析方法加以核对。

用薄层 层析法探索柱层分离条件,是实验室的常规方法。在进行柱层分离时,首先考 虑选用何种吸附剂与洗脱剂。在洗脱 过程中各个成分将按何种顺序被洗脱,每一洗 脱液中是否为单一成分或混合体,均可由 薄层的分离得到判断与检验。通过薄层的预分离,还可以 了解多组分样品的组成与相对含量。如在薄 层上摸索到比较满意的分离条件,即可将 此条件用于干柱层析。但亦可 以将薄层分离条件经适当改变,转至一 般往层所采用洗脱的方式进行制备柱分离。利用薄 层的预分离寻找柱层的洗脱条件时,假定在 薄层上所测得的Rf值一样 品在柱层中的比移率(R)。这是由 于在薄层展开时,薄层固 定相中所含的溶剂经过不断的蒸发,而使薄 层上各点位置所含的溶剂量是不等的,靠近起 始线的含量高于薄层的前沿部分。但若严 格控制层析操作条件,则可得到接近真实的Rf值。用薄层 进行某一组分的分离,其Rf值范围,一般情形下为0.85>Rf>0.05。此外,薄层层 析法亦应用于中草药品种、药材及 其制剂真伪的检查、质量控制和资源调查,对控制 化学反应的进程,反应副 产品产物的检查,中间体分析,化学药 品及制剂杂质的检查,临床和 生化检验以及毒物分析等,都是有效的手段。

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